Head

Проект фонда

 

Создание терапий на основе вирусных конструкций, содержащих гены, работа которых замедляет старение и усиливает стресс-ответ организма

 

Аннотация

Причины и механизмы старения консервативны у многих животных, поэтому в настоящее время не вызывает сомнений наличие генетической составляющей в определении продолжительности жизни. Экспериментальные подходы на модельных объектах различных животных позволили выявить ряд генов, изменение экспрессии которых сопровождается существенным увеличением продолжительности жизни. Трансляция этих методов для клинического использования с целью существенного продления жизни человека определяется прежде всего развитием методов генной терапии. Задачами данного проекта являются 1) поиск генов, длительная оверэкспрессия которых позволит существенно увеличить продолжительность жизни млекопитающего; 2) разработка метода обеспечения длительной оверэкспрессии трансгена в организме млекопитающего при его доставке в составе вирусных частиц. Для достижения поставленных целей будут созданы вектора, содержащие кДНК генов, оверэкспрессия которых в эксперименте была ассоциирована с увеличением продолжительности жизни. Будет проведена их однократная или многократная трансдукция в организм модельного млекопитающего (мыши) и оценены эффекты экспрессии трансгенов на продолжительность жизни животного и на различные биохимические и физиологические показатели. Полученные в ходе выполнения проекта результаты создадут основу для создания генно-терапевтических препаратов, направленных на принципиальное продление жизни человека.

Введение

В настоящее время накоплено много данных по полиморфизмам у человека и животных, ассоциированных с увеличением продолжительности жизни и уменьшением темпов старения. Выявлением полиморфизмов занимаются сразу несколько международных проектов, среди которых  New England Centenarian Study и Genetics of Healthy Aging. Гены, полиморфизмы которых ассоциированы с увеличением продолжительности жизни, относятся к различным функциональным группам, что согласуется с взглядом на старение как на комплексный  и многокомпонентный процесс. Условно можно выделить несколько функциональных групп генов старения и продолжительности жизни:

- гены окислительного стресса (гены белков дыхательной цепи митохондрий и цикла трикарбоновых кислот, регуляторы окислительно-восстановительного потенциала),
- гены температурного стресса (гены белков теплового шока),
- гены аутофагии (удаление побочных продуктов метаболизма и поврежденных молекул и органелл),
- гены инсулинового сигналинга и жирового обмена (ограничение питания и гормональная регуляция),
- гены контроля длины теломер и ошибок в ДНК, регуляторы транскрипции,
- гены гормональной регуляции.  

В результате экспрериментальных генетических вмешательств были установлены множественные взаимосвязи между изменением экспрессии конкретных генов и увеличением продолжительности жизни модельных объектов.

Механизмы, определяющие продолжительность жизни консервативны у различных групп организмов. Например, изменения экспрессии генов igf1r, ins1, cat, msra, ucp2 как у мыши, так и их гомологов у дрозофилы  определяют увеличение продолжительности жизни. Поэтому разработка методов направленных генетических вмешательств на модели млекопитающего в дальнейшем позволит осуществить трансляцию этих методов в клинику.

Генная терапия (генотерапия) – это набор допустимых генетических вмешательств в организм человека, основанных на доставке генов или кДНК в клетки, с терапевтическими целями. Одним из основных способов доставки генетического материала в клетки человека и модельных организмов является доставка в составе вирусных векторов, такой способ доставки получил название трансдукция. Несмотря на то, что мнение научного сообщества о возможностях генной терапии колебалось от чрезмерно оптимистичного до попытки закрыть данное направление, тем не менее в июле 2012 года Европейское медицинское Агентство рекомендовало к применению в США и Европе первый препарат генной терапии Glybera, направленный на лечение форм панкреатита, вызванных недостатком липазы липопротеинов. Несомненно, что при взвешенном  подходе генная терапия представляет собой перспективное направление, как для лечения врожденных генетических дефектов, так и для преодоления возрастных изменений, например, для активации регенеративных процессов.

Первым примером использования генной терапии для преодоления возрастных изменений служит недавно появившаяся работа Bernardes de Jesus с соавторами (2012 г), в которой осуществлена доставка в организм мыши гена теломеразы под контролем CMV промотора в составе частиц адено-ассоциированного вируса. В результате экспрессии трансгена было достигнуто увеличение продолжительности жизни животных примерно на 20% , длительное сохранение таких физиологических характеристик, как чувствительность к инсулину, плотность костей, нервно-мышечная координация и других. В дальнейшем встает вопрос о расширении списка генов, экспрессия которых методами генной инженерии может существенно продлить жизнь модельным животным и поиске генов с максимальным эффектом. Кроме того, несмотря на то, что экспрессия трансгенов наблюдается в течение нескольких месяцев после трансдукции, актуальным вопросом является поиск способов поддержания экспрессии трансгенов на временных интервалах, сопоставимых со временем старения человека для возможностей дальнейшей трансляции результатов в клинику.

Цели

1) протестировать возможность существенного увеличения продолжительности жизни мыши при оверэкспрессии генов-кандидатов ucp2 и sirt1 при их доставке в составе вирусных частиц;
2) разработка метода повторных введений вирусных векторов для обеспечения длительной оверэкспрессии трансгена в организме млекопитающего.

Подходы

  1. Выбор вектора

В генной терапии в настоящее время нашли применения вектора на основе частиц вирусов: аденовирусов, вируса простого герпеса, адено-ассоциированных вирусов, онкоретровирусов, лентивирусов. Для целей данного проекта наиболее подходящими являются вектора на основе адено-ассоциированных вирусов (ААВ):
- обладают сравнительно низкой иммуногенностью и цитотоксичностью ( в сравнении с аденовирусами и вирусом простого герпеса),
- способны заражать неделящиеся клетки,
- не реплицируются в организме,
- длительное (более полугода) поддержание экспрессии трансгена в организме,
- рекомбинантные формы ААВ не встраиваются в геном клетки, а остаются в составе конкатемерных плазмид  (т. е. исключается инсерционный мутагенез, присущий онкоретровирусам и лентивирусам),
- относительно безопасны, болезни вызываемые ААВ дикого типа неизвестны.

Следует добавить, что единственный до настоящего момента рекомендованный препарат генной терапии Glybera, был создан на основе ААВ.

К недостатком векторов на основании адено-ассоциированных вирусов следует отнести сложность получения, сравнительно низкий уровень трансдукции, низкая емкость (5т п н). Однако эти ограничения, по-видимому, не являются лимитирующими для достижения поставленных задач.

Предполагается использование рекомбинантных ААВ, не способных к интеграции в геном клетки-хозяина. Доступны для использования ААВ различных серотипов, сочетание которых позволит снизить иммунный ответ при повторных введениях трансгена (см. ниже).

  1. Выбор генов для экспрессии

UCP2 (uncoupling protein 2). UCP2 относится к группе разобщающих белков внутренней митохондриальной мембраны. Он участвует в переносе протона через внутреннюю митохондриальную мембрану, стабилизируя мембранный потенциал и предотвращая образование активных форм кислорода. Этот белок экспрессируется во всех тканях, но максимальный уровень наблюдается в мозге и скелетных мышцах. Большинство исследований предполагает его нейропротективную роль: повышение уровня экспрессии UCP2 наблюдается при инсульте, травмах мозга, в животных моделях эпилепсии и болезни Паркинсона (Bechmann et al., 2002, Kim et al., 2007, Mattiasson et al., 2003, Nakase et al., 2007). Возможный механизм нейропротективного действия UCP2 связан с супрессией про-воспалительных цитокинов и увеличением медиаторов клеточного цикла, направленных на клеточное выживание (фосфорилированной формы АКТ, РКС, МЕК) (Haines and Li, 2012). Недавно была установлена роль Ucp2 в процессе клеточного фагоцитоза. У мышей, нокаутных по ucp2, макрофаги были неспособны к фагоцитозу in vitro, а тимус и семенники не были способны освобождаться от умерших клеток, накапливая их (Park et al., 2011). Известно, что снижение эффективности автофагии является одной из составляющих процесса старения тканей. При оверэкспрессии ucp2 в нейронах было достигнуто увеличение средней продолжительности жизни у мышей на 15-20% (Conti et al., 2006). Эффект увеличения продолжительности жизни также наблюдался и при оверэкспрессии ucp2 уDrsosophilamelanogaster (Fridell et al., 2005).

SIRT1.  Sirt1 – эволюционно консервативный белок с NAD+зависимой деацетилазной активностью. Он является медиатором метаболических процессов, связанных с ограничением калорий (calorie restriction). В моделях нейродегенеративных болезней Sirt1 проявляет нейропротекторное действие (de Ollveira et al., 2010). Были получены трансгенные мыши, оверэкспрессирующие Sirt1 под контролем промотора прионного белка (Jiang et al., 2011). Максимальный уровень белка наблюдался в мозге, хотя оверэкспрессия также наблюдалась и в периферических тканях. К сожалению, о продолжительности жизни этой линии мышей не сообщается, однако, известно, что линия жизнеспособна и плодовита. Оверэкспрессия sirt1 у Drsosophilamelanogaster приводит к увеличению максимальной продолжительности жизни на 57% (Rogina et al., 2004), в силу эволюционной консервативности белков SIRT1 можно предполагать аналогичных эффект и в организмах млекопитающих. Недавно было установлено, что в мышиной модели болезни Хантингтона, известной как синдром преждевременного старения, при оверэкспрессии  Sirt1 наблюдается более позднее наступление симптомов, увеличение моторной активности, снижение атрофии мозга. Эффект связан с увеличением деацетилированной формы Foxo3a, транскрипционного фактора, направляющего клетку на путь выживания (Jiang et al., 2011).

  1. Получение трансгенов

кДНК Sirt1 и Ucp2, а также кДНК eGFP будут клонированы в вирусные вектора AAВ. Длина кДНК выбранных генов составляет около 4 кб, что соответствует информационной емкости AAВ векторов. Для экспрессии клонированных генов в вектора будет встроен промотор цитомегаловируса (CMV), данный промотор позволит обеспечить сильную и ткане-неспецифичную экспрессию трансгенов, как альтернативный вариант будет использован промотор прионного белка, позволяющий добиться экспрессии трансгенов преимущественно в нервной системе.

  1. Получение ААВ частиц

Для получения трансгенных ААВ частиц производится трансфекция клеток линии НEK293 одновременно тремя плазмидами: плазмидой с инвертированными повторами, между которыми находится изучаемый ген, плазмидой, экспрессирующей белки Rep и Саp, необходимые для сборки вирусных частиц, хелперной плазмидой, несущей гены аденовируса, необходимые для литического развития ААВ.
Выделяют несколько серотипов ААВ на основании антигенных детерминант белка оболочки Cap: ААВ1,2,5,7,8,9 и др. Эффективность инфекции будет зависеть от предсуществующих в организме млекопитающего антител к соответствующим серотипам. Дополнительные серотипы могут быть получены при направленном мутагенезе гена белка-оболочки Cap (Maersch et al., 2010). При планировании повторных трансдукций представляется эффективным использовать разные серотипы для введения одного и того же трансгена для минимизации иммунного ответа со стороны организма. Кроме того, вирусные частицы различных серотипов имеют разную предпочтительность к клеткам мишеням, поэтому меняя серотип частицы можно модулировать тканеспецифичность доставки трансгена, хотя этот вопрос изучен недостаточно и заранее предсказать тканеспецифичность того или иного серотипа представляется затруднительным. Планируется получать частицы двух-трех серотипов для одного и того же трансгена. Клетки выращиваются до 80% конфлюэнтности, затем ААВ частицы выделяются центрифугированием в градиенте хлористого цезия.

  1. Трансдукция в организм мыши

Планируется использовать мышей линии С57BL6 по 10 животных для каждой экспериментальной точки. Введение может осуществляться как мышам среднего возраста (1 год), так и старым мышам (2 года). ААВ частицы предполагается вводить в кровоток при помощи инъекций. Один и тот же трансген может вводиться однократно, двукратно или трехкратно с промежутками в 6 месяцев для изучения возможности обеспечить длительное поддержание трансгена в организме млекопитающего. Для преодоления проблемы иммуносупрессии необходимо: 1) использовать высокоэффективные экспрессионные промоторы, которые позволят увеличить уровень экспрессии трансгена в расчете на одну вирусную частицу, тем самым создавая возможность снизить количество частиц; 2) использовать различные серотипы ААВ, комбинировать разные серотипы при необходимости повторного введения; 3) сопровождать инъекции ААВ частиц в организм иммуносупрессорной терапией препаратами циклоспорин, mycophenolate mofetil и/или метилпреднизолон.

  1. Оценка уровня экспрессии трансгенов в тканях

Для оценки уровня экспрессии трансгенов в тканях предполагается использовать прижизненный иммунофлуоресцентный анализ (для животных, которым производились инъекции ААВ-eGFP), Western-blot гибридизацию, количественный RT-PCR.

  1. Оценка продолжительности жизни

Построение кривых выживания позволит определить среднюю и максимальную продолжительности жизни в экспериментах.

  1. Оценка физиологического состояния животных

Будет производиться измерения уровня локомоторной активности и нейромышечной координации в аппаратах и лабиринтах; плотность костной ткани (денситометрия); измерение слоя подкожного жира (гистологический анализ прижизненных пункций и посмертных образцов); измерение уровня глюкозы в крови, уровней инсулина и IGF1.

  1. Определение уровня специфических мишеней Ucp2 и Sirt1

У животных, которым будут проведены инъекции трансгенов, экспрессирующих Ucp2, будут определены способность макрофагов к фагоцитозу, уровни про-воспалительных цитокинов и медиаторов клеточного цикла. У животных, которым будут проведены инъекции трансгенов, экспрессирующих Sirt1,  будет определен уровень Foxo3a и его мишеней.

  1. Тесты на безопасность применения генной терапии

Возможный инсерционный мутагенез будет оценен с помощью Southern blot гибридизации геномной ДНК различных органов. Предполагается производить оценку уровня опухолеобразования у животных в опытных и контрольных экспериментах.
Планируемые направления экспериментов:

  1. Установление уровня экспрессии трансгена eGFP в зависимости от дозы и кратности введения. Сравнение эффектов при повторных введениях ААВ одного и того же или различных серотипов. Оценка иммунологического статуса организма при первичном и повторном введении ААВ.
  2. Изучение тканеспецифичности распределения трансгена в организме в зависимости от используемого серотипа ААВ и промотора, направляющего экспрессию на примере ААВ-eGFP конструкций.
  3. Изучение роли оверэкспрессии Ucp2 в определении продолжительности жизни и скорости старения организма.
  4. Изучение роли оверэкспрессии Sirt1 в определении продолжительности жизни и скорости старения организма.

2009-2013 Благотворительный фонд поддержки научных исследований «Наука за продление жизни»
Открытость – наша политика! При использовании материалов ссылка на сайт не обязательна